Verfeinerung der RPPA-Techniken zur genauen Quantifizierung von Phosphoproteinen in festen Geweben:
Das Reverse-Phase-Protein-Array (RPPA) ist eine robuste Technik für die quantitative Proteomik, die insbesondere für die Erstellung von Profilen posttranslationaler Modifikationen (PTMs) in endlichen Gewebeproben wie denen von Patienten nützlich ist. Trotz der Bemühungen, gewebebasierte RPPA-Anwendungen zu optimieren, bestehen nach wie vor technische Herausforderungen, einschließlich der Validierung von RPPA-anwendbaren Antikörpern, die für eine genaue Quantifizierung entscheidend ist.
In einer kürzlich durchgeführten Studie haben sich die Forscher dieser Herausforderung gestellt, indem sie einen RPPA-basierten Phospho-Antikörper-Charakterisierungsansatz zur systematischen Quantifizierung von Phosphoproteinen in festen Geweben entwickelt haben, der für die Identifizierung und Validierung von Biomarkern entscheidend ist. Der vorgeschlagene Arbeitsablauf verwendet einen mit alkalischer Phosphatase (AP) kompatiblen Lysepuffer für das Antikörperscreening und unterscheidet sich damit von herkömmlichen RPPA-Verfahren. Durch die Anwendung dieser Methode auf frisch gefrorenes (FF) und in Formalin fixiertes, in Paraffin eingebettetes (FFPE) Gewebe testeten sie ihre Anwendbarkeit und Wirksamkeit.
Die Arrays wurden mit einem GeSiM Nano-Plotter 2.0 präzise aufgespottet, was eine hohe Genauigkeit und Konsistenz gewährleistet. Durch das Screening von 106 Phospho-Antikörpern wiesen die Forscher nach, dass die AP-Behandlung als unabhängiger Faktor für die schnelle Auswahl von Phospho-Antikörpern dienen kann und eine hohe Reproduzierbarkeit und Spezifität in klinischen Proben aufweist.
Diese Ergebnisse ermöglichen einen effizienten Arbeitsablauf für die Charakterisierung von Phospho-Antikörpern mit RPPA und stellen einen bedeutenden Fortschritt in der gewebebasierten Proteomik dar. Dieser neuartige Ansatz ist sehr vielversprechend für die Entwicklung klinischer Tests.
Entnommen aus Abb. 1: Bewertung der durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase induzierten Wirkung bei 8 Zelllinien im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. (a) Unüberwachtes hierarchisches Clustering von Lysaten, die mit AGLyse mit oder ohne zusätzliche AP-Behandlung für 8 Zelllinien (SEM, LX-7, U2OS, HFC, LNCaP, 293T, MCF7 und Huh7) erzeugt wurden. Phospho-Antikörper sind gelb und Gesamtantikörper (Nicht-Phosphor) sind schwarz markiert.
Dieser Artikel basiert auf der folgenden Veröffentlichung:
Wang, N., Zhang, L., Ying, Q. et al. A reverse phase protein array based phospho-antibody characterization approach and its applicability for clinical derived tissue specimens. Sci Rep 12, 22373 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26715-9
